Gaston Daigle, Ph.D., C.S.P.Q.

Biochimiste clinique
Service clinique de biochimie
Centre hospitalier régional du Grand-Portage
75, rue St-Henri
Rivière-du-Loup (Québec)
G5R 2A4
courriel: gaston_daigle@ssss.gouv.qc.ca

INDEX

1. Introduction
2. Matériels et méthodes
3. Résultats
4. Discussion
5. Bibliographie

Introduction

Plusieurs cas d'intoxication au monoxyde de carbone ont été déclarés au Québec dûs à différentes causes dont entre autres une tentative suicidaire (1), un incendie, un moteur à combustion mal ajusté, etc.. La disponibilité d'un co-oxymètre pour la mesure de la carboxy-hémoglobine n'est pas très fréquente dans les hôpitaux du Québec. Les centres dépourvus de cet équipement doivent se tourner vers d'autres centres, occasionnant ainsi des délais dans l'analyse du spécimen et dans le traitement des patients intoxiqués. Une méthode spectrophotométrique a déjà été décrite par Tietz (2), utilisant la lecture séquentielle, à deux longueurs d'onde très proches, d'un hémolysat de sang total réduit par l'hydrosulfite de sodium. Le but de ce travail est de standardiser les étapes de cette méthode afin de réduire au minimum l'imprécision inter-essai, d'évaluer la performance analytique de cette méthode, de la comparer à une méthode de co-oxymétrie, et de proposer un contexte clinique d'utilisation de cette méthode spectrophotométrique.

Matériels et méthodes

Le spectrophotomètre utilisé est un STASAR III (Gilford Instruments, Canada) muni d'un sélecteur de longueur d'onde de 1 nm avec une précision de bande passante de ± 2 nm. L'hydroxyde d'ammonium (NH₄OH 0,12 M) et l'hydrosulfite de sodium (233 mg dilués dans 1,0 mL de NH₄OH 0,12 M) proviennent de Fisher Canada. Les échantillons de carboxy-hémoglobine proviennent de Coulter Électronique du Canada Ltée (IL Multi-4 CO Oximeter Control TM, level 1-2-3 [cat no 033162-00] et level 4 [cat no 033122-50]). Ces contrôles sont obligatoires car ils contiennent de l'hémoglobine humaine purifiée, condition essentielle pour la mesure de la carboxy-hémoglobine par spectrophotométrie. Les valeurs cibles des contrôles du niveau 2 (appelé étalon 0,017) et du niveau 4 (appelé étalon 0,919) ont été obtenues par co-oxymétrie. Le co-oxymètre utilisé est un ABL-520 (Radiometer Canada).

Le principe de la méthode est le suivant : Les propriétés spectrales de l'oxy-hémoglobine et de la carboxy-hémoglobine sont différentes. Un traitement à l'hydrosulfite de sodium d'un hémolysat modifie le spectre de l'oxy-hémoglobine sans modifier celui de la carboxy-hémoglobine. Un ratio entre les densités optiques à 541 nm et 555 nm des étalons d'HbCO (hémoglobine humaine purifiée) permet l'élaboration d'une courbe d'étalonnage (figure 1). Les résultats obtenus des spécimens de patients, traités de la même façon, sont dérivés de cette courbe.

La méthode suivante, qui a été modifiée, est utilisée.

1. La longueur d'onde de 541 nm est sélectionnée et le 0,000 est ajusté avec le NH₄OH 0,12 M en utilisant la cellule d'aspiration. Tout en laissant le NH₄OH 0,12 M dans la cellule, la longueur d'onde de 555 nm est sélectionnée et la D.O. obtenue est notée (cette D.O. doit être soustraite de celle mesurée en 5), ce qui permet de corriger pour le blanc à 555 nm.



2. Un hémolysat est préparé pour chacun des contrôles (niveau 3 et niveau 1 des contrôles de COULTER) et deux hémolysats (DUPLICATA) sont préparés pour chaque patient (sang prélevé sur EDTA) en ajoutant 20 uL de spécimen à 5,0 mL de NH₄OH 0,12 M. Le mélange est agité par inversion et incubé 2 minutes.



3. Pendant ce temps, la solution d'hydrosulfite de sodium est préparée en pesant 233 mg de Sodium Hydrosulfite (Sodium Dithionite) et diluée avec 1,0 mL de NH₄OH 0,12 M.



4. A toutes les 30 secondes, 100 uL d'hydrosulfite de sodium sont pipettés dans les hémolysats en prenant soin d'agiter par inversion après chaque addition d'hydrosulfite. La pipette de 100 uL est rincée avec de l'eau distillée après chaque addition.



5. La D.O. à 541 nm est lue après exactement 5 minutes puis, immédiatement après, celle de 555 nm. Le sélecteur est replacé à 541 nm puis la cuvette est rincée avec du tampon NH₄OH 0,12 M.



6. La séquence est répétée pour tous les tubes tel que décrit en 5).



7. Pour chaque spécimen, la D.O. déterminée en 1) est soustraite de la D.O. mesurée à 555 nm. Le ratio D.O. 541 nm / D.O. 555 nm est déterminé pour chaque spécimen, et la moyenne des 2 résultats est calculée. La fraction d'HBCO est déterminée sur la courbe étalon. Cette dernière est construite à partir du contrôle niveau 2 (0,017 d'HbCO) et du contrôle niveau 4 (0,919 d'HbCO), étalonnés au co-oxymètre. Pour l'étalon bas, on peut aussi utiliser un témoin négatif.

Résultats

Le tableau 1 regroupe les ratios moyens de D.O. des étalons 0,017 et 0,919 pour 10 courbes d'étalonnage. Ces ratios sont très stables et permettent l'utilisation d'une courbe étalon sur plusieurs mois, voire quelques années. Notre courbe étalon (figure 1), construite à partir de la moyenne de ces 10 ratios, a d'ailleurs été utilisée pendant 3 ans avec satisfaction.

Figure 1. Courbe étalon de la carboxy-hémoglobine avec l'étalon 0,017 d'HbCO et l'étalon 0,919 d'HbCO.

Le tableau 2 présente les résultats de l'étude d'imprécision inter-essais pour 3 lots différents du niveau 1 et du niveau 3 des contrôles. Les coefficients de variation se situent entre 3,7% - 6,9% et 12,6% - 13,7% pour des niveaux d'HbCO respectifs de 0,581 et 0,173.

Une étude de corrélation a été effectuée entre la méthode spectrophotométrique et la co-oxymétrie. Le graphique de la (figure 2) montre la relation entre les 2 méthodes. Les paramètres de régression suivants ont été obtenus : Y = 1,047 X - 0,007 où Sy/x = 0,018, r = 0,9914 et n = 29. Ces données montrent, qu'en moyenne, les résultats de la méthode spectrophotométrique sont en deça de 5% de ceux de la co-oxymétrie. Pour les valeurs entre 0,10 et 0,30 d'HbCO, le biais positif est de l'ordre de 10% - 12%.

Discussion

Étant donné l'utilisation peu fréquente de cette méthode dans certains centres, il est impératif de bien standardiser toutes les étapes afin de minimiser l'imprécision de cette méthode spectrophotométrique. Parmi les conditions préalables, un spectrophotomètre performant (bande passante ± 2 nm), l'utilisation de la même cellule de mesure en tout temps et le chronométrage de 5 minutes précises de chacune des réactions permettent une meilleure reproductibilité de lecture. Ceci se répercute sur la précision des dosages où les coefficients de variation des contrôles de qualité sont très acceptables pour les besoins cliniques. De plus, la corrélation entre la méthode spectrophotométrique et la co-oxymétrie, considérée comme méthode de référence, est très bonne car les écarts sont inférieurs à 5% en moyenne. Dans un contexte d'intoxication, les résultats d'HbCO cliniquement importants sont ceux de plus de 0,15 (tableau 3). Les résultats d'HbCO inférieurs à 0,05 sont beaucoup moins importants et corrèlent d'ailleurs moins bien que les autres plus élevés.

Dans son article original, Tietz (2) utilisait comme étalon primaire un cylindre de CO à 100% pour fabriquer un étalon d'HbCO pur. Cette procédure n'est pas dénuée de danger car ce produit est très toxique, surtout en milieu fermé. Nous avons préféré utiliser des contrôles d'HbCO à base d'hémoglobine humaine dosés au co-oxymètre à plusieurs reprises et d'utiliser la valeur moyenne comme valeur cible. L'étude de corrélation montre que les résultats de carboxy-hémoglobine sont similaires.

Tel que mentionné dans la référence 2, la présence de methémoglobine n'interfère pas dans le dosage car cette dernière est réduite par l'hydrosulfite de sodium, au même titre que l'oxy-hémoglobine. Seule la sulpho-hémoglobine peut interférer car elle n'est pas réduite par l'hydrosulfite. Cependant sa présence, quoique peu fréquente, peut être détectée à 620 nm, le cas échéant.

En conclusion, cette méthode peut être utilisée par tout laboratoire qui possède un spectrophotomètre adéquat à condition d'utiliser des étalons d'hémoglobine humaine purifiée. Les résultats générés sont très utiles dans un contexte d'intoxication au monoxyde de carbone et permettent une démarche thérapeutique plus précoce.

L'auteur tient à remercier sincèrement M. Réal Gagné, biochimiste au centre hospitalier régional de Rimouski, qui a gracieusement réalisé les essais en co-oxymétrie.

Références

1. Daigle G, Présentation de cas : Intoxication au monoxyde de carbone. Ann Biochim Clin Qué, 1992; 31 (2): 26 - 28.


2. Tietz NW, Fiereck EA, The Spectrophotometric Measurement of Carboxyhemoglobin. Ann Clin Lab Sci, 1973 ; 3 (1): 36 - 42.


3. Blanchette G, Aspects cliniques et thérapeutiques de l'intoxication au monoxyde de carbone: expérience de 29 cas traités en chambre hyperbare. Le clinicien, avril 1990, pp 81 - 91.