Ann Biochim Clin Qué 35 (3): 66-70 (1996)

Figure 1. Hybridation in situ avec la sonde polyvalente Omniprobe.Les cellules infectées par le virus (coloration pourpre des noyaux) démontrent des altérations caractéristiques des koïlocytes.

PCR

Des sections de 10 µm de tissu paraffiné furent coupées avec un microtome en utilisant une nouvelle lame pour chacun des blocs afin d'éviter les contaminations entre les blocs de paraffine. Par mesure de précaution, les deux premières coupes ont été jetées et la troisième placée dans un microtube contenant 150 µl de tampon d'extraction (50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA; 0.5% Tween et 300 µg/ml protéinase K). Les tubes furent chauffés à 60^oC pendant 3 heures et ensuite à 99^oC pendant 90 secondes. Après une brève centrifugation, le surnageant fut recueilli et utilisé pour le PCR. Les amorces MY09 et MY11 de Ting et Manos (20) situées dans la région conservée du gène L1 ont été utilisées. L'amplification des séquences virales s'effectue dans un volume de 100 µl contenant 10 µl d'ADN, du KCl à 5 mM, du Tris-HCl pH 8,5 à 10 mM; du MgCl₂ à 5 mM; 200 µM de chacun des désoxynucléotides triphosphates, 20 pmoles de chacune des amorces et 2.5 unités de Taq polymérase (Life-Technologies, Gaithersburg, MD) dans le Robocycler de Stratagene (La Jolla, CA) selon le programme suivant: 1 cycle de 95^oC, 55^oC et 72^oC, 3 minutes à chaque température et 34 cycles de 95^oC - 55 sec, 55^oC - 60 sec et 72^oC - 80 sec. Ce système de PCR permet d'amplifier au moins 25 sous-types génitaux du virus HPV (20). Afin de contrôler la qualité de l'ADN isolé des blocs de paraffine, nous avons amplifié en parallèle une séquence de la région constante du gène du récepteur des lymphocytes T. Les produit de PCR furent séparés sur gel d'agarose (1,5%), colorés au bromure d'éthidium et visualisés sous ultraviolet.

Résultats

Les résultats décrits dans cette étude représentent une analyse rétrospective de cas cliniques soumis pour une évaluation histopathologique au département de pathologie de notre hôpital au cours d'une année. Chacune des biopsies a été évaluée par un des cinq pathologistes oeuvrant à cette époque au département. Parmi les 527 biopsies de lésions cervico-vaginales et ano-génitales incluses dans cette étude, 69 ont été classifiées comme lésions non-spécifiques (cervicite chronique et métaplasie épidermoïde), 33 comme des lésions possiblement reliées au HPV et 425 biopsies comme des lésions reliées aux infections par le virus HPV. Toutes ces biopsies ont été examinées pour détecter la présence des séquences du génome du virus HPV par la méthode d'hybridation moléculaire in situ. Les résultats obtenus apparaissent au Tableau 1. La présence du virus a été détectée par hybridation in situ dans 4 des 69 lésions (6%) classifiées comme non-spécifiques et dans 12 des 33 lésions (36%) possiblement reliées au virus HPV. Dans le groupe des lésions classifiées par un pathologiste comme lésions reliées à l'infection par HPV le génome viral a été détecté dans seulement 31% des lésions (dans 130 sur 425 cas).

Plus précisément, le virus a été détecté dans 18 des 54 biopsies (33%) classifiées dysplasies sévères (CINIII) et dans 21 des 52 (40%) dysplasies modérées (CINII). Ces pourcentages correspondent aux valeurs attendues, car dans les lésions de haut grade le nombre de copie du virus par cellule est trop faible pour être détecter par hybridation in situ (13, 14). Dans les lésions de faible grade, le génome du virus HPV n'a pu être mis en évidence que dans 20 des 127 (16%) dysplasies légères (CIN I) et dans 71 des 192 (37%) lésions classifiées condylomes (Tableau 1). Ce résultat est étonnant car dans ces lésions le virus est en phase réplicative où des milliers de particules infectieuses sont produites; conséquemment le taux de détection aurait dû être beaucoup plus élevé que des valeurs de 37% et de 16%, respectivement.

La divergence observée entre les résultats de l'examen histologique des lésions de faible grade et de l'analyse moléculaire peut s'expliquer par: (i) le manque de spécificité du diagnostic histo-morphologique, (ii) l'infection par un sous-type viral non-reconnu par les sondes utilisées lors de l'hybridation, (iii) par la sensibilité insuffisante de l'hybridation in situ. Afin de distinguer laquelle de ces possibilités pourrait être à l'origine des différences observées, nous avons choisi au hasard 14 biopsies pour chacune des sous-catégories histologiques et nous les avons analysées par PCR. La grande sensibilité de cette technique et sa capacité à détecter la présence d'au moins 25 sous-types génitaux du virus du papillome humain (20) nous permettent de valider les donnés obtenues par hybridation in situ.

Les résultats de cette expérience apparaissent dans le Tableau 2. Pour des biopsies classifiées comme lésions non-spécifiques, les deux méthodes confirment l'absence du virus dans le tissu. Pour les 14 lésions classifiées "condylome" les résultats négatifs ou positifs d'hybridation in situ ont été confirmés par PCR dans 13 cas (93%); une seul biopsie négative par HIS a été détectée comme positive par PCR. Des résultats semblables ont été obtenus pour les 14 lésions classifiées dysplasies légères : la présence du virus a pu être détectée par PCR et par hybridation in situ dans 7 cas et dans 7 autres cas le virus n'a pu être détecter par les deux méthodes. En revanche, parmi les 28 lésions de grade élevé (CIN II et CIN III) seulement 15 cas (13 cas positifs par HIS et 2 cas négatifs par HIS) présentaient des résultats concordants entre l'hybridation in situ et la méthode PCR. Treize cas (46%) qui étaient considérés négatifs par HIS ont été positifs par PCR.

Un avantage supplémentaire de la détection moléculaire du virus HPV dans les biopsies cervico-vaginales est la possibilité de déterminer le sous-type du virus présent dans la lésion. Nous avons effectué le typage du virus pour 108 cas pour lesquelles une réaction positive avec la sonde polyvalente Omniprobe™ fut obtenue (Figure 2). Dans 32 cas, le sous-type viral n'a pu être déterminé à l'aide des sondes utilisées. Les sous-types non-oncogéniques 6 et 11 ont été retrouvés dans 25 biopsies, plus précisément dans 22 condylomes, dans un cas classifié comme lésion non-spécifique, un cas classifié comme dysplasie légère et un autre cas classifié dysplasie modéré. Les sous-types oncogéniques 16 et 18 (34 cas) ainsi que 31, 33 et 35 (17 cas) ont été détectés dans tous les catégories des lésions mais il étaient proportionnellement plus fréquents dans les lésions CIN I, II et III, que dans des condylomes.

Discussion

La spécificité (capacité d'éviter le diagnostic faux-positif) et la sensibilité (capacité de détecter tous les cas positifs, soit d'éviter le diagnostic faux-négatif) sont les critères importants pour toute méthode diagnostique. Dans le cas de l'évaluation microscopique la subjectivité de l'observateur accentue la relation inverse entre la sensibilité et la spécificité. Plus la sensibilité augmente, plus la spécificité diminue. Inversement, l'augmentation de la spécificité entraîne habituellement une diminution de la sensibilité (21). Dans le diagnostic des lésions du col utérin, certains observateurs adoptent un ensemble de critères morphologiques plus vastes qui, pour un groupe donné, leur permet de détecter presque toutes les lésions précancéreuses. Cependant, parmi les cas classifiés comme positifs se retrouvent aussi quelques lésions non-spécifiques, qui ne contiennent pas de virus. D'autres observateurs adoptent plutôt des critères beaucoup plus stricts. Ils classifient comme positives uniquement les lésions regroupants tous les critères morphologiques requis. Pour ce dernier groupe d'observateurs, le nombre de faux-positifs est faible mais le pourcentage de faux-négatifs peut être considérablement élevé, car dans les cas douteux ils seront tentés de poser le diagnostic négatif. Nos résultats reflètent plus probablement la première possibilité, car la corrélation entre les signes morphologiques d'infection virale détectée par un spécialiste et la présence du génome d'HPV est relativement faible, surtout pour des lésions classifiées comme faible grade. Pour l'approche morphologique, il est très difficile d'établir le taux exact de diagnostics faux-positifs et faux-négatifs posés par un pathologiste ou un laboratoire diagnostique. Une étude publiée récemment (22) et impliquant 1217 pathologistes et 1095 cytotechnologistes démontre que l'évaluation des biopsies cervico-vaginales par un seul spécialiste produit environ deux fois plus de résultats faux-positifs et faux-négatifs (18,5%) que l'analyse effectuée par une équipe de quelques pathologistes et cytotechnologistes (10,6%). Le seul moyen permettant le contrôle de la qualité du diagnostic microscopique est la consultation adressée à un autre spécialiste ou un groupe de spécialistes. Malgré cette variabilité le diagnostic histo-morphologique des lésions de col utérin est encore souvent considéré comme la méthode de choix, sur laquelle repose la décision clinique concernant le traitement.

Puisque l'infection par le virus du papillome humain représente le plus important facteur de risque identifié pour le cancer du col utérin et que le virus peut être détecté dans plus de 90% des cas de carcinome du col (7, 11), la détection moléculaire du virus dans les lésions permet d'estimer l'exactitude de l'analyse histo-morphologique des biopsies cervicales. Dans notre étude, nous avons voulu établir une corrélation entre la détection du génome du virus HPV et les résultats de l'analyse histo-morphologique et vérifier si la détection moléculaire de ce virus pouvait contribuer à améliorer le diagnostic des lésions précancéreuses du col.

Dans le groupe des biopsies classifiées comme non-spécifiques par le pathologiste, nous observons une bonne corrélation entre l'approche histo-morphologique et l'hybridation in situ puisque seulement 6% de ces cas se sont révélés positifs par l'hybridation. Par contre, pour les biopsies classifiées comme dysplasies et condylomes, on observe une discordance entre le diagnostic histomorphologique et l'hybridation in situ. Dans les lésions classifiées "faible grade" (condylomes et dysplasies légères) le taux de détection du virus par hybridation in situ avec la sonde Omniprobe devrait se situer autour de 90% (19). Selon nos résultats (Tableau 1), le virus HPV a été détecté uniquement dans 37% des condylomes et 16% des dysplasies légères. L'analyse additionnelle d'un échantillonnage de 14 condylomes et 14 lésions classifiées "CIN I" avec une méthode plus sensible (PCR) a confirmé les résultats d'hybridation in situ dans 27 cas sur 28 (96%) - voir Tableau 2. Ce résultat confirme que pour ce groupe de lésions, l'hybridation in situ est un test fiable et presque aussi sensible que le PCR. Par conséquent, le faible pourcentage de détection du virus par hybridation in situ dans les lésions évaluées "condylome" et "CIN I" (37% et 16%, respectivement - Tableau 1) laisse supposer que le taux de faux-positifs pour l'évaluation histo-morphologique de ces deux catégories a été très élevé. Des conclusions similaires découlent de nos études antérieures où l'hybridation in situ concordait mieux avec l'évaluation histo-morphologique effectuée par un groupe de 6 pathologistes - 72% de concordance - qu'avec l'évaluation effectué par un seul pathologiste - 36% de concordance - (donnés non publiées, I.G.F. et coll.). Il n'est pas surprenant que des lésions de faible grade, surtout CIN I, peuvent poser un problème diagnostique important. Les modifications morphologiques de ces lésions ne sont pas aussi prononcées que dans les dysplasies modérées et sévères. Voilà pourquoi les altérations inflammatoires ou réparatoires peuvent être parfois confondues avec les véritables caractéristiques des dysplasies prémalignes.

Pour le groupe de biopsies classifiées comme "haut grade" (CIN II et CIN III) le virus a été détecté par hybridation in situ dans seulement 46% des cas (13 sur 28, Tableau 2), tandis que la technique PCR a permit de détecter l'ADN viral dans la plupart de ces biopsies (26 sur 28, soit 93%). Ce résultat apporte un argument en faveur de la spécificité du diagnostic histo-morphologique pour des lésions de haut grade et laisse supposer que le faible niveau de détection du virus par l'hybridation in situ (40% et 33%, Tableau 1) découle davantage du manque de sensibilité de cette technique, que de l'inexactitude de l'évaluation histologique.Nous pouvons donc conclure, que dans cette étude la classification histo-morphologique a été beaucoup plus spécifique pour les lésions de haut grade que pour les lésions de faible grade. L'analyse moléculaire complémentaire s'avère donc plus utile pour les lésions classifiées condylomes et dysplasies légères que pour les dysplasies modérées et sévères.

La détermination du sous-type du virus HPV (Figure 2)apporte une information supplémentaire pour la classification des lésions pré-cancéreuses. La présence des sous-types 6 et 11 permet de classifier la lésion dans le groupe à faible risque de progression maligne car ces sous-types sont retrouvés, à une exception près, uniquement dans les lésions condylomateuses et dysplasies légères. Par contre, la présence des sous-types oncogéniques 16, 18, 31, 33 ou 35 dans toutes les catégories de lésions indique que les lésions condylomateuses et CIN I représentent les premiers stades d'infections par ce groupe de virus, qui, à une certaine fréquence, évolueront vers la néoplasie. Les patients avec des lésions de faible grade infectées par les HPV oncogéniques se retrouve donc dans un groupe à risque plus élevé pour la progression maligne. Des résultats similaires ont été récemment publiés par d'autres équipes de recherche (6, 8, 11).

Les résultats de cette étude permettent de formuler quelques conclusions générales:

1. L'évaluation histo-morphologique des lésions précancéreuses du col utérin n'est pas entièrement satisfaisante, surtout pour les lésions de faible grade.


2. La détection moléculaire du virus HPV dans les biopsies cervicales par hybridation in situ permet d'améliorer la spécificité du diagnostic des lésions de faible grade (dysplasie légère et condylome).


3. L'hybridation moléculaire in situ est beaucoup moins utile pour l'évaluation des lésions plus avancées (dysplasies modérée, sévères et carcinomes).


4. La détermination du sous-type du virus HPV ajoute une valeur additionnelle à la classification des lésions précancéreuses du vagin et du col utérin.

Remerciements: Les auteurs sont reconnaissants à Mme Kathy Quinn et M. Martin Demers pour leur excellent travail technique.

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