Le diagnostic précoce des fistules
de liquide céphalo-rachidien reçoit depuis quelques
années une attention particulière puisque cette
condition pathologique peut entraîner la mort si elle n'est
pas détectée par les examens radiologiques et cliniques
traditionnels. Une protéine spécifique du LCR, la
ß2-transferrine, a récemment suscité un grand
intérêt diagnostique pour le dépistage de
telles fistules car elle peut maintenant être mise en évidence
dans les fluides d'otorrhée et de rhinorrhée. Nous
avons développé une approche qualitative de révélation
de la ß2-transferrine dans ces fluides par une méthode
électrophorétique très spécifique
et de haute sensibilité faisant appel à une immunofixation
intensifiée au polyéthylène glycol suivi
d'une coloration au nitrate d'argent. En effet, il est possible
de détecter aussi peu que
0,5 ng/bande de ß2-transferrine, ce
qui est cinq fois plus sensible que les meilleures méthodes
électrophorétiques déjà existantes
sur agarose pour ces types de dépistage. De plus, l'utilisation
d'un appareillage moderne complètement automatisé
facilite l'implantation de cette nouvelle approche dans un contexte
clinique de routine puisqu'elle requiert beaucoup moins de temps
technique. Cette examen ultra-spécialisé s'inscrit
désormais au Québec comme un outil biochimique sensible
et rapide dans l'arsenal diagnostique en otorhinologie.
Depuis quelques années, les fistules
céphalo-rachidiennes reçoivent une attention particulière
puisque cette condition pathologique est maintenant considérée
dans l'étiologie de divers problèmes d'ordre otologique
ou neurologique, tel qu'une raideur de la nuque, des tintements,
des pertes d'équilibre et des vertiges ainsi que des méningites
récurrentes. Cette dernière manifestation est souvent
fatale d'où la nécessité de poser un diagnostic
précoce.
La majorité des cas de fistules de
liquide céphalo-rachidien (LCR) est la conséquence
d'un traumatisme important à la tête ayant engendré
une fracture du crâne, mais elles peuvent aussi se produire
à la suite d'une chirurgie intra-crânienne. Cette
fracture, souvent localisée sur l'os temporal ou dans la
fosse crânienne antérieure ou médiane, provoque
un déchirement de la dure-mère générant
ainsi une fistule de LCR dans les sinus, le nasopharynx ou l'oreille
moyenne (1). L'incidence réelle des
fistules céphalo-rachidiennes est difficile à évaluer
car, dans la plupart des cas, elles se résorbent spontanément.
Cependant, une étude effectuée chez une population
pédiatrique a rapporté que 20 à 26 % des
patients présentant une fracture de l'os temporal avaient
une fistule de LCR (2).
Malgré les importants progrès
technologiques en radiologie, certaines fistules ne sont pas détectées.
Le diagnostic repose donc principalement sur l'évaluation
clinique et sur l'exclusion d'autres pathologies (3).
Pour le clinicien, il devenait donc primordial d'identifier un
outil diagnostique, en l'occurrence un paramètre biochimique,
exclusif aux fluides s'écoulant de ces fistules sous forme
de LCR ou d'un mélange de LCR et de sécrétions
muqueuses.
Les analyses biochimiques effectuées
dans le passé pour l'examen des fluides d'otorrhée
et de rhinorrhée se composaient principalement d'un dosage
de protéines et d'une mesure de la gravité spécifique,
paramètres plus abaissés dans le LCR que dans les
sécrétions. Aussi, l'évaluation du glucose
et des chlorures offrait un certain potentiel discriminatoire
puisque ces paramètres avaient tendance à être
plus élevés dans le LCR que dans les sécrétions
(4). Cependant, toutes ces analyses ont été
laissées en marge dû à un manque évident
de spécificité. En effet, ces mêmes paramètres
biochimiques se retrouvent dans le sang, le liquide lacrymal,
la salive et les sécrétions. Les échantillons
d'otorrhée et de rhinorrhée devaient donc être
exempts de contamination avec ces liquides biologiques, une situation
plutôt improbable (5, 6).
Il en a été de même pour la transthyrétine
(pré-albumine), qui n'a jamais été considérée
comme un marqueur spécifique absolu du LCR puisqu'on retrouve
également cette protéine dans le sérum (6).
Par contre, l'isoforme cathodique de la transferrine
(TRF), la ß2-transferrine (ß2-TRF), qui compte approximativement
pour 15 % à 30 % de la transferrine totale présente
dans le LCR est presqu'exclusivement spécifique à
ce liquide biologique (6). On ne la retrouve
que dans la périlymphe (7), ainsi que
dans les humeurs vitrée (6) et aqueuse
(8) de l'oeil. Habituellement non détectable
dans le sérum, elle peut y apparaître en de rares
situations pathologiques (8) comme la cirrhose
hépatique.
La ß2-transferrine possède plusieurs
appellations; on la nomme asialo-transferrine, tau-transferrine
ou transferrine "carbohydrate deficient". L'origine
de la ß2-transferrine (9) de même
que son rôle dans le système nerveux central (6)
ne sont pas encore élucidés. Les hypothèses
suggèrent soit une synthèse par les oligodendrocytes
et les cellules choroïdiennes, soit une synthèse intrathécale
par l'action de la neuraminidase localisée dans le parenchyme
cérébral sur la transferrine sérique ayant
traversé la barrière hémato-encéphalique.
C'est effectivement la perte de ces résidus d'acide sialique
par l'action de la neuraminidase qui confère à la
transferrine de nouveaux caractères physico-chimiques,
produisant ainsi une isoforme asialisée, la ß2-transferrine
(6). La différenciation de la ß2-transferrine
de la protéine native peut alors s'effectuer par électrophorèse
de zone; la ß2-transferrine migrant dans la zone des ß2-globulines,
une position plus cathodique que la transferrine. La ß2-transferrine
possède la même capacité de liaison du fer
que la transferrine ainsi qu'une réactivité immunologique
similaire (6).
Les publications portant sur les premières
applications cliniques ayant mis à profit cette particularité
électrophorétique de la ß2-transferrine pour
le dépistage des fistules céphalo-rachidiennes (10-12)
et périlymphatiques (13) remontent à
peine à 8 ans. Ces méthodes consistent généralement
en des techniques d'électrophorèse sur gel d'agarose,
requérant beaucoup de temps technique, d'importants volumes
de LCR et démontrant une insensibilité relative.
La détection de la ß2-transferrine s'effectue ensuite
par immunobuvardage sur nitrocellulose ou par immunofixation,
la révélation étant obtenue par une coloration
au nitrate d'argent ou au bleu de Coomassie. Des techniques immunochimiques
peuvent également être employées (1,
4,6, 12,
14). Les inconvénients inhérents
à ces méthodes comportent entre autres la nécessité
de concentrer les échantillons et d'utiliser ensuite des
volumes de concentré de LCR pouvant aller, selon la technique,
jusqu'à 50 µL. Ces exigences limitent l'application
puisque, dans certains cas d'otorrhée ou de fistules périlymphatiques,
seulement quelques microlitres de fluide peuvent être récoltés.
Également, le choix de la méthode de révélation
est primordiale pour l'atteinte d'une très grande sensibilité.
En effet, une coloration au nitrate d'argent possède un
seuil de détection de 5 ng/bande comparativement à
100 ng/bande pour le bleu de Coomassie. Par
contre, une coloration à base de nitrate d'argent implique
des exigences de sécurité beaucoup plus élevées
pour le travailleur.
Nous avons donc développé une
approche électrophorétique qualitative encore plus
sensible et très spécifique pour le dépistage
des fistules céphalo-rachidiennes par la détection
de la ß2-transferrine dans les fluides d'otorrhée
et de rhinorrhée. Cette méthode rapide et complètement
automatisée requiert des volumes minimes d'échantillons.
De plus, l'utilisation d'une procédure de coloration au
nitrate d'argent automatisée et en circuit fermé
apporte des avantages indéniables. Nous présentons
également les résultats obtenus chez des patients
souffrant principalement d'otorrhée.
Tous les réactifs entrant dans la composition
des tampons et solutions sont de qualité conforme aux normes
ACS. Le matériel utilisé pour l'électrophorèse
de zone (gels, bandelettes de tampon, peignes) de même que
les divers réactifs constituant la trousse de coloration
au nitrate d'argent sont une gracieuseté de Pharmacia Biotech
(Baie d'Urfé, Québec). Ces réactifs sont
prêts pour utilisation. L'antisérum de transferrine
humaine OSAX 14/15 (lot no. 153011) ainsi que le standard de protéines
N (lot no. 083603) contenant de la transferrine humaine proviennent
de chez Behring (Montréal, Québec). La neuraminidase
type V de Clostridium perfringens (E.C. 3.2.1.18, lot no. 31H82301)
a été obtenue chez Sigma (St-Louis, Missouri). Les
échantillons de sérum, de LCR et les fluides du
nez et de l'oreille ont été récoltés
selon les procédures médicales standards.
Nous avons d'abord comparé la migration
électrophorétique de la transferrine et de la ß2-transferrine
dans le sérum et dans le LCR. Les échantillons de
sérum ont été dilués à 1/400,
1/800 et 1/1000 avec de la saline 9 g/L et ceux de LCR à
1/2 et 1/4. Brièvement, 4 µL de chaque dilution de
sérum et de LCR, ainsi que 4 µL de LCR pur ont été
appliqués sur un gel de polyacrylamide homogène
7,5 %, totalisant 6 échantillons par gel. L'électrophorèse
a été réalisée en duplicata en conditions
natives sur l'unité de séparation de l'appareil
PhastSystem (Pharmacia Biotech, Baie d'Urfé, Québec)
à 600 V, 3,5 W, 12,5 mA et à une température
de 15 °C pendant 182 Vh.
Immunofixation avec un antisérum
de transferrine (anti-TRFh) humaine
L'antisérum de transferrine a été
dilué à 1/10 et 1/50 avec une solution de PBS (0,15
M NaCl, 20 mM phosphate pH 7,4) contenant 30 g/L de PEG 6000 (BDH
Chemicals, Toronto, Canada), afin de déterminer la concentration
d'antisérum optimale pour nos essais. 300 µL de la
dilution 1/10 ont été appliqués sur un gel
et 300 µL de la dilution 1/50 sur l'autre gel. Les gels ont
ensuite été incubés 1 heure à la température
ambiante et lavés avec la solution de PBS-PEG pendant la
nuit tout en maintenant une légère agitation.
Coloration au nitrate d'argent
La coloration des gels a été
effectuée sur l'unité de développement de
l'appareil PhastSystem (Pharmacia Biotech) selon le protocole
standard recommandé par la compagnie.
Nous avons évalué la sensibilité
de notre méthode par l'analyse de différentes dilutions
d'un standard de transferrine contenant 3,0 g/L avec de la saline
9 g/L. À partir d'une solution-mère de 30 mg/L,
11 échantillons ont été préparés
par dilution séquentielle à la demie (30 mg/L à
15 µg/L). 4 µL de chaque dilution ont été
appliqués sur des gels. Les procédures d'électrophorèse,
d'immunofixation (anti-TRFh dilué à 1/50) et de
coloration ont été opérées tel que
décrit ci-dessus.
De façon à évaluer les
proportions dans lesquelles le LCR provenant de fistules doit
être présent dans les sécrétions du
nez ou de l'oreille pour que la ß2-transferrine puisse être
détectée, nous avons procédé à
la préparation de différentes dilutions de LCR pur
avec de la saline 9 g/L. Nous avons obtenu des dilutions s'échelonnant
entre 1/2 et 1/1000. L'électrophorèse de zone, l'immunofixation
(1/50) et la coloration ont été effectuées
tel que décrit.
Afin de confirmer l'identification de la ß2-transferrine
dans le LCR, nous avons effectué un traitement à
la neuraminidase sur du sérum et du LCR. Nous avons d'abord
reconstitué la neuraminidase lyophilisée dans 100
µL de tampon citrate-phosphate 0,05 M, pH 5,0. 10 µL
de cette solution ont été ajoutés à
50 µL de sérum dilué à 1/800 ainsi qu'à
50 µL de LCR dilué 1/2 (dans la saline 9 g/L). Après
15 minutes d'incubation à 37 °C, la réaction
enzymatique a été ralentie par l'utilisation d'un
bain de glace. Une autre série a ensuite été
effectuée avec, cette fois, une incubation de 30 minutes.
4 µL de chaque milieu réactionnel ont été
appliqués sur un gel, le sérum 1/800 et le LCR 1/2
non traités servant de contrôles. Nous avons alors
procédé à l'électrophorèse,
l'immunofixation (1/50) et la coloration tel que décrit
ci-haut.
Pour fins d'investigation, le service d'O.R.L.
de l'Hôpital Notre-Dame nous a fourni trois échantillons
d'otorrhée et un échantillon de rhinorrhée
provenant de trois patients. Les trois échantillons d'otorrhée
ont été dilués à 1/8 et 1/16 avec
de la saline 9 g/L et l'échantillon de rhinorrhée
a été dilué à 1/4. Nous avons ensuite
appliqué 4 µL de chaque dilution et de l'échantillon
de rhinorrhée pur sur le gel et procédé à
l'électrophorèse, suivie de l'immunofixation (1/50)
et de la coloration au nitrate d'argent.
Des dilutions 1/8 avec de la saline 9 g/L
ont été effectuées pour les trois échantillons
d'otorrhée, une dilution 1/4 pour l'échantillon
de rhinorrhée. Ensuite 3 µL de neuraminidase reconstituée
ont été mélangés à 50 µL
de chacune des dilutions et à 50 µL de l'échantillon
de rhinorrhée pur, donnant 75 mU d'enzyme/échantillon.
Après une heure d'incubation à 37°C, 4 µL
de chaque échantillon traité ont été
appliqués sur le gel en alternance avec les échantillons
non-traités correspondants. L'électrophorèse,
l'immunofixation (1/50) et la coloration ont été
réalisées tel que décrit précédemment.
L'isoforme asialisée de la transferrine
présente dans le LCR, la ß2-transferrine, migre à
une position plus cathodique que la protéine native. Pour
illustrer ce fait, une électrophorèse de zone a
été effectuée sur des dilutions de LCR et
de sérum (Figure 1). Il est effectivement possible d'observer
une bande à la même position pour tous ces échantillons.
Cette bande correspond à la transferrine circulante et
cette affirmation a été confirmée ultérieurement
par la migration parallèle d'un standard de transferrine
(voir Figures 5 et 6). On peut voir que cette transferrine tétrasialisée
est plus abondante dans le sérum et le LCR (4)
que la ß2-transferrine que l'on retrouve effectivement du
côté cathodique dans les seuls échantillons
de LCR (Figure 1A). Cette figure démontre bien que, même
en excès d'antigène avec une concentration d'anticorps
anti-transferrine trop élevée provoquant un effet
de prozone, la ß2-transferrine ne peut être révélée
dans le sérum alors que sa présence est bien évidente
dans le LCR. Nous avons également déterminé
les concentrations optimales de chacune des composantes afin d'obtenir
une bonne qualité visuelle de l'analyse. Il nous a donc
semblé préférable de diluer le LCR à
la demie (200 mg/L de protéines), le sérum à
1/800 (80 mg/L de protéines) et d'utiliser l'antisérum
de transferrine dilué à 1/50 pour éviter
un excès d'antigène et pour obtenir une meilleure
résolution (Figure 1B).
Pour déterminer le seuil de détection
de notre approche, un standard de transferrine a été
dilué de façon à donner des concentrations
s'échelonnant entre 15 µg/L et 30 mg/L de transferrine.
Comme le démontre la Figure 2, la dilution pour laquelle
la transferrine est encore détectable correspond à
celle appliquée en position 9, soit 0,12 mg/L de TRF ou
approximativement 0,5 ng de TRF par bande.
Les fluides provenant de fistules de LCR se
présentent plus fréquemment sous forme d'un mélange
de LCR et de sécrétions muqueuses plutôt que
sous forme de LCR pur. Afin d'estimer la tolérance de notre
méthode sur ce point, il est important d'évaluer
la concentration minimale détectable de LCR dans ces sécrétions.
Pour ce faire, nous avons analysé différentes dilutions
de LCR préparées dans la saline 9 g/L allant de
1/2 à 1/1000. Tel que démontré à la
Figure 3 (position 7), une dilution de 20 fois du LCR est tolérée,
la ß2-transferrine pouvant y être encore mise en évidence.
Ce seuil de détection correspond à 0,05 µL
de LCR pur par µL d'échantillon appliqué. On
peut tenter d'estimer la quantité de ß2-transferrine
par bande au seuil de détection de la méthode à
partir des concentrations de protéines dans le sérum
et le LCR et de la teneur sérique en transferrine. Un calcul
proportionnel nous fournit une teneur approximative de 10 à
15 mg/L de TRF dans le LCR. La ß2-TRF représentant
environ 15 % à 30 % de la TRF du LCR (6),
on peut supposer une teneur de l'ordre de 2 à 5 mg/L de
ß2-TRF dans ce type de liquide biologique. À partir
de ces inférences, nous pouvons estimer le seuil de détection
de la ß2-TRF de l'ordre de 0,4 à 1 ng/bande, sachant
que 4 µL d'échantillon de LCR dilué 1/20 sont
appliqués par puits. Ces résultats s'accordent avec
le seuil de sensibilité de la méthode qui permet
une détection de 0,5 ng de TRF/bande, tel que nous l'avons
déterminé lors de l'expérience précédente.
La neuraminidase a pour fonction de désialiser
la transferrine circulante qui comporte généralement
quatre résidus d'acide sialique. Cette réaction
enzymatique conduit alors à la formation de l'isoforme
ß2-transferrine, qui ne comporte aucun résidu. L'évaluation
du produit de la réaction de la neuraminidase sur du sérum
et du LCR demeure donc le meilleur moyen pour confirmer l'identité
de la ß2-transferrine. Nous pouvons observer, après
électrophorèse des divers milieux réactionnels
(Figure 4), un déplacement de la transferrine du sérum
et du LCR vers une position plus cathodique, au même niveau
que la ß2-transferrine présente dans le contrôle
de LCR. Dans nos conditions, après seulement 15 minutes
d'incubation, la transformation de la transferrine en ß2-transferrine
par l'action de la neuraminidase est complète.
Nous avons également vérifié
la présence de ß2-transferrine dans des liquides
d'écoulement du nez et de l'oreille obtenus du département
d'O.R.L. de l'Hôpital Notre-Dame et provenant de trois patients
avec suspicion d'une fistule de LCR. Comme nous le démontre
la Figure 5, les patients A et C (otorrhée) ont obtenu
un résultat positif pour la ß2-transferrine tandis
que la présence de ß2-transferrine pour le patient
B (rhinorrhée) s'est avérée négative.
L'action de la neuraminidase sur la TRF amène
sa désialisation. La ß2-TRF issue de cette action
enzymatique se superpose ainsi à la ß2-TRF naturellement
présente dans le LCR, pour ne former qu'une seule bande.
Les échantillons d'otorrhée et de rhinorrhée
ont donc été traités à la neuraminidase
afin de confirmer indirectement la présence réelle
de ß2-transferrine dans ces fluides. Les mêmes échantillons
non traités ont été utilisés en guise
de contrôle. Nous pouvons observer (Figure 6) la transformation
de la transferrine circulante, présente dans ces 4 échantillons,
en ß2-transferrine. Les bandes satellites s'échelonnant
entre la transferrine et la ß2-transferrine correspondent
à des isoformes de la transferrine portant vraisemblablement
des nombres intermédiaires de résidus d'acide sialique
(4).
Les complications inhérentes au dépistage
tardif des fistules de LCR ont été clairement décrites
(1-4). Différentes approches ont déjà
été utilisées et le sont encore maintenant
pour révéler la présence de ß2-transferrine
dans les fluides provenant de fistules. Cependant, ces quelques
méthodes sont effectuées sur gel d'agarose, ce qui
engendre certains désavantages. D'abord, elles requièrent
des quantités importantes d'échantillons qui doivent
par la suite être concentrés 10 à 20 fois,
ce qui entraîne des coûts supplémentaires (1,
12, 13, 15,
16). De plus, les méthodes décrites
par Meurman et coll. (15) et par Zaret et coll.
(8) nécessitent jusqu'à 50 µL
d'échantillon concentré. Ces méthodes sont
donc inutilisables lorsque le volume de fluide d'otorrhée
ou de rhinorrhée prélevé est insuffisant.
Cependant, certains auteurs utilisent des volumes d'application
entre 2 µL et 7 µL d'échantillon pur ou dilué
mais ont recours à des méthodes de détection
sophistiquées. Notre approche ne requiert qu'un maximum
de 4 µL d'échantillon dilué avec une procédure
analytique automatisée.
L'électrophorèse de zone offre
une bien meilleure résolution sur gel de polyacrylamide
que sur gel d'agarose (5). Si l'on compare
les seuils de détection rapportés dans la littérature
pour les méthodes d'électrophorèse sur gel
d'agarose, on peut noter que ces seuils sont, au minimum, de l'ordre
de 10 à 20 fois plus élevés que ceux rapportés
en électrophorèse sur polyacrylamide. De fait, la
méthode sur gel d'agarose de Zaret et coll. (8)
nécessite un minimum de 15 µL de LCR pur pour visualiser
la ß2-TRF à l'électrophorèse, celle
d'Oberascher et coll. (10), 1 µL et celle
de Yokoyama et coll. (11) comporte un seuil
de détection minimal de 400 mg/L de ß2-transferrine.
La seule approche effectuée sur gel de polyacrylamide et
qui est répertoriée, celle de Reisinger et Hochstrasser
(5), comporte effectivement des caractéristiques
bien supérieures à celles citées ci-haut;
ces auteurs rapportent que la ß2-transferrine peut être
détectée dans seulement 0,1 µL de LCR pur,
ce qui correspond à 0,5 ng de protéine. Nous avons
montré que notre approche, également effectuée
sur gel de polyacrylamide, se compare avec celle de Reisinger
(0,05 µL de LCR pur). Le seuil de détection de notre
méthode est de 0,5 ng de TRF par bande, soit l'équivalent
de 0,12 mg/L. De plus, en se basant sur les calculs estimant la
concentration de ß2-transferrine dans le LCR, nous pouvons
visualiser entre 0,4 et 1 ng de ß2-TRF/bande. Ce résultat
corrobore la limite de détection de la méthode que
nous avons déterminée.
La comparaison entre notre méthode
et celle de Reisinger (5) est à notre
avantage et la différence se situe principalement au niveau
de la simplicité et de la rapidité d'exécution
ainsi qu'au niveau de la sécurité pour le personnel
technique. En effet, la procédure décrite par Reisinger
est relativement complexe. Outre l'électrophorèse,
elle consiste en un immunobuvardage sur nitrocellulose suivi d'une
coloration à l'or colloïdal nécessitant des
manipulations dans une chambre noire. Le temps d'exécution
de cette technique totalise environ 9 heures et elle est entièrement
manuelle. Elle peut donc difficilement être implantée
en laboratoire clinique. Notre approche, par contre, est rapide,
ne requérant que 3 heures de temps technique, puisque l'étape
de coloration est entièrement automatisée et l'électrophorèse
se réalise en un peu moins de 30 minutes.
Contrairement aux techniques d'immunobuvardage
qui sont employées très couramment, nous avons plutôt
choisi d'utiliser une technique d'immunofixation beaucoup plus
simple, qui consiste à appliquer un antisérum anti-transferrine
humaine dilué dans du PBS contenant du PEG. Cette technique
d'immunofixation a précédemment été
rapportée pour le dépistage de bandes oligoclonales
dans le LCR (17). Le rôle du PEG dans
l'immunofixation est de créer un effet polymère.
Généralement, la solubilité d'une protéine
en présence d'un polymère linéaire, tel que
le PEG, est inversement proportionnelle au poids moléculaire
de ce polymère. Cet effet se traduit par un mécanisme
d'exclusion stérique entraînant une diminution du
volume de solvant pouvant solubiliser la protéine, ce qui
engendre la précipitation de celle-ci (18).
Ainsi, lorsqu'une immunofixation intensifiée au PEG précède
une coloration au nitrate d'argent, la sensibilité de cette
dernière est grandement améliorée, passant
de 5 ng/bande (19) à 0,5 ng/bande.
Lorsqu'on se penche sur la question de la
spécificité de la méthode, il est maintenant
bien reconnu que la ß2-TRF est actuellement le meilleur
marqueur du LCR et de la périlymphe (7).
Cependant, il a été rapporté, par l'équipe
de Sloman et coll. (14) que des variants alléliques
de la transferrine pouvaient conduire à la détection
de faux positifs pour la présence de fistules de LCR. Également,
le dosage de la ß2-TRF sérique a été
proposé pour le dépistage de l'alcoolisme chronique,
la ß2-TRF sérique étant, cette fois, un marqueur
possible de cette condition (8). Si les fluides
d'otorrhée et de rhinorrhée sont contaminés
avec du sang ayant des taux notables de ß2-TRF sérique,
cette situation peut également conduire à de faux
résultats positifs pour la présence de fistules
de LCR. Il est donc essentiel de procéder de façon
concomitante au dépistage de la ß2-TRF sur les liquides
d'otorrhée et de rhinorrhée et sur un échantillon
de sérum correspondant, utilisé à titre de
contrôle (8). Pour nos fins d'évaluation,
seuls les liquides d'otorrhée et de rhinorrhée ont
été utilisés, les sérums correspondants
n'étant pas disponibles. En contexte clinique toutefois,
le prélèvement de sérum est strictement requis
pour interprétation.
D'après les résultats obtenus
sur les échantillons d'otorrhée et de rhinorrhée
(Figures 5 et 6), nous avons remarqué la présence
de bandes satellites correspondant à des isoformes de TRF
portant vraisemblablement un nombre intermédiaire de résidus
d'acide sialique. Cette observation a également été
rapportée par Keir et coll. (4). Pour
les fins cliniques de l'examen que nous avons développé,
nous nous intéressons à la stricte recherche de
la ß2-TRF. La valeur clinique des différentes isoformes
de la TRF demeure à explorer.
Nous avons présenté une approche
qualitative de révélation de la ß2-transferrine
dans les fluides d'otorrhée et de rhinorrhée. Cette
méthode électrophorétique est d'une sensibilité
cinq fois supérieure à la meilleure méthode
sur gel d'agarose publiée (10), sans
considérer l'aisance d'exécution et la sécurité
pour le personnel. Elle s'effectue conjointement avec une immunofixation
intensifiée au polyéthylène glycol et une
coloration subséquente au nitrate d'argent s'effectuant
en circuit fermé. L'utilisation d'un appareillage moderne
et complètement automatisé facilite l'implantation
de cette approche dans un contexte clinique de routine, dû
à sa rapidité et sa simplicité d'exécution.
Elle s'inscrit ainsi comme un outil biochimique sensible et rapide
dans l'arsenal diagnostique en otorhinologie.
